大孔树脂法分离纯化那他霉素的工艺研究

摘要: 目的    研究大孔吸附树脂分离纯化那他霉素发酵液的工艺,提高那他霉素成品质量,得到高纯度药用级那他霉素。方法    用HPLC检测方法,以那他霉素的洗脱率为指标,考察大孔树脂分离纯化那他霉素的吸附性能和洗脱参数。结果    那他霉素从发酵液中的**佳溶出pH值为11;分离纯化那他霉素的有效吸附剂为大孔吸附树脂HZ816,其动态吸附量为150mg/mL,解吸收率在90%以上,成品纯度大于98%。结论    该高纯度药用级那他霉素的规模化分离纯化方法为国内**应用,工艺简单可靠,分离效果好,适于工业化生产。
关键词: 那他霉素;大孔吸附树脂;分离纯化
中图分类号:     文献标识码: A
 
Studies on Separation and Purification of Natamycin by Macroporons Resin
 
 
Wang Hai-yan, Li Xiao-lu, Wang Jian, Zhang Li, Lin Yang, Zhang Jin-juan, Zhang Xue-xia
(New Drug Research & Development Company of NCPC, National Engineering Research Center of Microbial Medicine, Shijiazhuang 050015)
 
Abstract   Objective   The method that separation and purification of high-purity Natamycin for pharmaceutical use from fermentation broth by macroporous resins was studied. Methods   Based on adsorption capacity and elution efficiency of Natamycin, the conditions to separation and purification of Natamycin by macroporous resins were optimized. Results   The optimum pH value for releasing Natamycin from the fermentation broth was 11. HZ816 was selected as the effective macroporous adsorbent for separation and purification of Natamycin from fermentation broth. The desorption rate of Natamycin was over 90% and the purity of the final product was over 98% under the optimal conditions. Conclusion   This method about separation and purification of high-purity Natamycin for pharmaceutical use was discovered for the first time and was warranted for the commercial process.
Key words   Natamycin; Macroporous resin; Separation and purification
 
那他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素,是一种白色**乳白色几乎无臭无味的结晶粉末。分子式C33H47NO13,分子量为665.73。化学结构式如下:
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图1    那他霉素的结构式
Fig. 1    The structure of natamycin
 
那他霉素是那塔尔链霉菌(Streptomyces natalenis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosPoreus)等微生物的次生代谢产物,从发酵液中提取纯化后获得。那他霉素是一种高效、低毒的具有广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和藻类剂,可以用于医疗、食品、饲料、粮储防霉,特别是在食品原料保鲜、食品防腐等方面具有良好的使用[1, 2]
那他霉素是两性物质,分子中含有一个碱性基团和一个酸性基团,其电离常数pKa值为8.35和4.6,相应的等电点为6.5。由于那他霉素含有4个相连的双键结构,决定了那他霉素几乎不溶于水,微溶于甲醇,溶于冰醋酸[3]。由于那他霉素的溶解特性,很多用于那他霉素分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离[4, 5]。这些提取过程使用的溶剂量大,损耗大,成本高,很难实现规模化生产。
本文采用大孔吸附树脂从发酵液中将目的产物分离、富集、结晶、干燥,在国内**实现了规模化的高纯度药用级那他霉素的分离纯化,产品质量符合国家药典要求,收率稳定,设备投资少,适于工业化生产。
1    仪器与材料
高效液相色谱仪(996检测器,515泵,Waters公司); Loborata 4000旋转蒸发器(Heidolph公司);PHS-3c型酸度计上海雷磁仪器厂);TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。
那他霉素发酵液(华药集团新药公司生物工程室提供);那他霉素标准品(购自美国Sigma公司)。大孔树脂D312、DA201、HZ816、HZ801(上海华震科技有限公司),大孔树脂 Amberlite XAD16HP (美国罗门哈斯公司) ,大孔树脂X-5、AB-8(安徽三星树脂科技有限公司),大孔树脂HPD-100(天津海光化工有限公司);去离子水(本实验自制);乙腈(色谱纯,美国Merk公司);工业乙醇(沧州兴隆化工有限公司);其他试剂均为国产分析纯。
2    方法与结果
2.1    HPLC法测定那他霉素的含量
色谱柱:Extend C18 (4.6×250mm, 5µm);流动相:乙腈-水-0.01 mo1/L醋酸铵缓冲溶液(70︰30);流速:1.0mL/min;检测波长:303nm;进样量:10µL。那他霉素保留时间为9.2min。
2.2  发酵液预处理及溶液pH值对那他霉素溶出率的影响
2.2.1    发酵液预处理  由于那他霉素主要存在于菌丝体内,且发酵液中杂质较多,不利于直接进行树脂吸附。首先在发酵液中加入7%的珍珠岩,搅拌30min后真空抽滤,水顶洗,得那他霉素菌丝体。