大孔树脂法分离纯化那他霉素的工艺研究

摘要： 目的    研究大孔吸附树脂分离纯化那他霉素发酵液的工艺，提高那他霉素成品质量，得到高纯度药用级那他霉素。方法    用HPLC检测方法，以那他霉素的洗脱率为指标，考察大孔树脂分离纯化那他霉素的吸附性能和洗脱参数。结果    那他霉素从发酵液中的**佳溶出pH值为11；分离纯化那他霉素的有效吸附剂为大孔吸附树脂HZ816，其动态吸附量为150mg/mL，解吸收率在90%以上，成品纯度大于98%。结论    该高纯度药用级那他霉素的规模化分离纯化方法为G内**应用，工艺简单可靠，分离效果好，适于工业化生产。
关键词： 那他霉素；大孔吸附树脂；分离纯化
中图分类号：     文献标识码： A
 
Studies on Separation and Purification of Natamycin by Macroporons Resin
 
 
Wang Hai-yan, Li Xiao-lu, Wang Jian, Zhang Li, Lin Yang, Zhang Jin-juan, Zhang Xue-xia
(New Drug Research & Development Company of NCPC, National Engineering Research Center of Microbial Medicine, Shijiazhuang 050015)
 
Abstract   Objective   The method that separation and purification of high-purity Natamycin for pharmaceutical use from fermentation broth by macroporous resins was studied. Methods   Based on adsorption capacity and elution efficiency of Natamycin, the conditions to separation and purification of Natamycin by macroporous resins were optimized. Results   The optimum pH value for releasing Natamycin from the fermentation broth was 11. HZ816 was selected as the effective macroporous adsorbent for separation and purification of Natamycin from fermentation broth. The desorption rate of Natamycin was over 90% and the purity of the final product was over 98% under the optimal conditions. Conclusion   This method about separation and purification of high-purity Natamycin for pharmaceutical use was discovered for the first time and was warranted for the commercial process.
Key words   Natamycin; Macroporous resin; Separation and purification
 
那他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，是一种白色**乳白色几乎无臭无味的结晶粉末。分子式C₃₃H₄₇NO₁₃，分子量为665.73。化学结构式如下：
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图1    那他霉素的结构式
Fig. 1    The structure of natamycin
 
那他霉素是那塔尔链霉菌(Streptomyces natalenis)、恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)或褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosPoreus)等微生物的次生代谢产物，从发酵液中提取纯化后获得。那他霉素是一种高效、低毒的具有广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和藻类剂，可以用于医疗、食品、饲料、粮储防霉，特别是在食品原料保鲜、食品防腐等方面具有良好的使用^{[1, 2]}。
那他霉素是两性物质，分子中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数pKa值为8.35和4.6，相应的等电点为6.5。由于那他霉素含有4个相连的双键结构，决定了那他霉素几乎不溶于水，微溶于甲醇，溶于冰醋酸^[3]。由于那他霉素的溶解特性，很多用于那他霉素分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离^{[4, 5]}。这些提取过程使用的溶剂量大，损耗大，成本高，很难实现规模化生产。
本文采用大孔吸附树脂从发酵液中将目的产物分离、富集、结晶、干燥，在G内**实现了规模化的高纯度药用级那他霉素的分离纯化，产品质量符合G家药典要求，收率稳定，设备投资少，适于工业化生产。
1    仪器与材料
高效液相色谱仪（996检测器，515泵，Waters公司）； Loborata 4000旋转蒸发器（Heidolph公司）；PHS-3c型酸度计（上海雷磁仪器厂）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
那他霉素发酵液（华药集团新药公司生物工程室提供）；那他霉素标准品(购自美GSigma公司)。大孔树脂D312、DA201、HZ816、HZ801（上海华震科技有限公司），大孔树脂 Amberlite XAD16HP (美G罗门哈斯公司) ，大孔树脂X-5、AB-8(安徽三星树脂科技有限公司)，大孔树脂HPD-100(天津海光化工有限公司)；去离子水（本实验自制）；乙腈（色谱纯，美GMerk公司）；工业乙醇（沧州兴隆化工有限公司）；其他试剂均为G产分析纯。
2    方法与结果
2.1    HPLC法测定那他霉素的含量
色谱柱：Extend C₁₈ (4.6×250mm, 5µm)；流动相：乙腈-水-0.01 mo1/L醋酸铵缓冲溶液(70︰30)；流速：1.0mL/min；检测波长：303nm；进样量：10µL。那他霉素保留时间为9.2min。
2.2  发酵液预处理及溶液pH值对那他霉素溶出率的影响
2.2.1    发酵液预处理  由于那他霉素主要存在于菌丝体内，且发酵液中杂质较多，不利于直接进行树脂吸附。shou先在发酵液中加入7%的珍珠岩，搅拌30min后真空抽滤，水顶洗，得那他霉素菌丝体。#p#分页标题#e#
2.2.2    溶液pH值对那他霉素溶出率的影响  提高那他霉素的成品质量和成品收率，菌丝体内那他霉素的溶出率是关键因素，为此根据那他霉素的两性特征，shou先考察不同pH值下那他霉素的溶出率，找到**佳溶出条件。将那他霉素菌丝体在不同pH值的水中搅拌2h，HPLC在线检测，其**佳溶出pH值见图2 (25℃) 。
 

 
 
图2    pH对那他霉素溶出率的影响
Fig. 2   　Effect of different pH on dissolution rate to natamycin
 
从图2 中可以看出，pH接近中性和偏低时不利于那他霉素的溶出，而pH过高对那他霉素有分解作用，本实验中确定pH=11为**佳溶出pH。
2.3    树脂的吸附和解吸
2.3.1    吸附条件的考察
2.3.1.1    树脂的预处理及再生  先用丙酮充分浸泡树脂，除去色素和杂质，并用蒸馏水洗涤，**洗涤液加丙酮不变浑为止。然后用4倍树脂体积的2mol/LHCl 溶液搅拌浸泡4h，用蒸馏水洗**中性。再用4倍树脂体积的2mol/LNaOH 溶液搅拌浸泡4h，洗**中性备用。再生的方法与预处理基本相同。
2.3.1.2    树脂的筛选  取预处理好的不同型号的大孔吸附树脂各100mL装柱，从上端加入那他霉素菌丝体浸提滤液，流速为2BV/h树脂床体积，并以HPLC在线检测出口液浓度，当出口液浓度接近上样液浓度10%时，认为树脂已吸附饱和并停止上样，计算吸附容量。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图3    不同型号树脂对那他霉素吸附量的比较
　Fig. 3  　 Comparision of absorption capacity of natamycin absorbed by different macroporous resins
 
根据那他霉素弱极性的特性，选用D312、DA201、HZ816、HZ801、Amberlite XAD16HP、X-5、AB-8和HPD-100等8种非极性大孔吸附树脂，在pH为7.0的条件下进行动态吸附筛选，结果见图3。
由图3可以看出，Amberlite XAD16HP大孔树脂具有**佳吸附性能，其次为HZ816大孔树脂。鉴于Amberlite XAD16HP大孔树脂为进口品，价格昂贵，因此确定用G产HZ816大孔树脂吸附分离那他霉素。其动态吸附量约为150mg/mL。
2.3.1.3    吸附pH的考察  将一定量的那他霉素浸提液分别调节成不同pH，然后使用HZ816树脂吸附，考察pH对HZ816树脂吸附量的影响，结果见图4。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图4    pH值对HZ816树脂吸附量的影响
Fig. 4   　Influence of pH on the adsorption capacity by macroporous resin HZ816
 
由图4可以看出，在pH为7.0时，吸附量**大。这跟那他霉素的稳定性有一定关系，那他霉素在pH 3-9中具有活性，在pH 5-7范围内稳定且活性**强。pH低于5, 那他霉素水解失去碳霉糖，并从四烯变为五烯结构，并引起那他霉素完全降解；pH高于9，那他霉素皂化降解。因此，那他霉素的**佳吸附pH为7.0。
2.3.1.4    吸附流速的考察  将一定量那他霉素浸提液分别以不同流速上HZ816树脂柱吸附，考察不同流速下HZ816树脂的吸附性能，结果见图5。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图5    上样液吸附流速对HZ816树脂吸附性能的影响
Fig. 5    Effect of different velocities of sample solution on adsorption capacity by HZ816
 
由图5可见，流速越慢，吸附越好。但流速过慢会延长生产周期，提高成本，因此采用中速即1.5-2.5BV/h树脂床体积作为吸附流速。
2.3.2    解吸条件的考察  选用甲醇、乙醇、丙酮等3种溶剂，采用静态吸附解吸的方法进行筛选。结果表明，乙醇和甲醇具有较好的解吸能力。由于乙醇毒性低于甲醇，因而选用乙醇作为解吸剂。
为了提高解吸收率，使洗脱高峰集中，将饱和树脂(120mL)用水、40%乙醇净化后，再用不同pH的氢氧化钠溶液和乙醇的混合液解吸，洗脱流速为0.5BV/h，实验结果见表1。
 
表1    洗脱条件的优化
Tab. 1    Optimization of the elution conditions
 

pH	60%乙醇		80%乙醇		90%乙醇
	体积（mL）	解吸率(%)	体积（mL）	解吸率(%)	体积（mL）	解吸率(%)
7	800	97.3	500	96.2	450	95.4
9	650	97.0	380	96.8	350	94.6
11	500	96.5	300	95.7	300	94.1
13	400	95.1	300	94.8	300	93.8

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由表1可知，pH=11的80%的乙醇溶液洗脱峰**集中，收率**高。而更高浓度的氢氧化钠由于碱性过大，破坏了那他霉素结构，收率明显降低。
2.4    结晶
用1mol/LHCL溶液调节浓缩液pH**5.0-6.5，使那他霉素沉淀析出，冷库静置12h，离心分离，得到那他霉素湿粉，用去离子水洗**中性，干燥，得那他霉素乳白色粉末，HPLC含量为98.3%。
3    讨论
本实验采用大孔吸附树脂HZ816分离纯化那他霉素，其吸附率和解吸率高，洗脱液中色素和杂质少，且洗脱高峰集中。重复3批实验，解吸收率均大于90%，成品纯度大于98%，成品折纯收率大于65%，说明HZ816树脂适合于高纯度那他霉素的提取分离。此外，该方法生产成本低，安全性高，收率稳定，具有较高的应用价值。