硒对铅、汞胁迫下大豆生长影响的研究

摘要：采用砂基培养法，研究硒对铅、汞胁迫下大豆生长的影响。对大豆幼苗的株高、结瘤率、植株根系所在沙质培养基pH、叶片干重、叶绿素、叶片丙二醛含量、叶片脯氨酸（Pro）含量、叶片光合效率植株叶片相对电导率以及保护酶POD活性的影响。结果表明，铅、汞胁迫下大豆植株矮化，重金属毒害使叶片失绿，干重降低，叶片 MDA 含量增加，POD 活性增强，硒可减轻铅和汞对于大豆的毒害，表现为: 
本试验以大豆为材料, 通过砂基培养, 旨在探讨硒对铅和汞胁迫下大豆生长和生理特性的影响, 以探讨硒能否抑制或缓解铅和汞对大豆的毒害。
关键词：硒 重金属 胁迫 生长影响
英文摘要：
英文关键词：selenium, heavy metal pollution, stress, soybean
 
1.前言：
大豆起源于中G，在中G栽培并用作食物及药物已有5000年的历史。大豆呈椭球形、球形，颜色有黄色、淡绿色、黑色等，故又有黄豆、青豆、黑豆之称。大豆营养丰富，含多种营养成分和生物活性成分，大豆含蛋白质约40%、脂肪20%、碳水化合物20%、粗纤维5%，并含多种矿物质和纤维素，营养价值很高。近些年来，人们发现大豆中有多种具有保健功能的成分，如大豆多肽，大豆低聚糖，大豆膳食纤维及大豆磷脂等，这些成分具有延年益寿、延缓衰老、降血压、降血脂、抗癌等功能。目前，已从传统的豆制品（豆腐、腐乳、豆浆）生产到工业化的豆制品生产，如大豆油，豆奶，大豆组织蛋白及大豆异黄酮，大豆卵磷脂等大豆保健品。
硒是广泛存在于自然界中的一种元素，它是人体内不可缺少的微量元素，缺硒是人体克山病、大骨节病的主要原因，会导致人及动物免疫功能下降，加重心脑血管病、糖尿病、癌症、克山病和镉中毒。^[1] 重金属污染是当今极受人们重视的环境污染问题之一。^[2] 铅(Pb)在环境中普遍存在，随着都市化、现代化进程的加快,铅已经成为我们生活中**常见的化学污染物。铅的多亲和性和蓄积性使得它进入人体后可引起人体许多器官的功能紊乱,包括神经、造血、消化系统及肾脏,同时还损害人体的免疫系统,使机体抵抗力下降。^[3] 汞(Hg)是一种广泛分布于环境中的剧毒重金属，^[4] 是一种高毒性重金属元素,但是由于其特殊的物理化学性质,在工业上又有着多种重要用途而被大量生产和使用,给环境带来了严重的影响。汞在环境中主要以单质汞(Hg)、无机汞(Hg⁺、Hg⁺²盐及其配合物)和有机汞(烷基汞、苯基汞)的形态存在。各种形态在自然环境中可以发生多种生物转化和化学转化,并通过食物链富集,对人类和动物造成极大的危害。^[5]而近些年的研究发现，硒具有促进植物新陈代谢和植物对环境胁迫的抗性，并具有拮抗重金属的作用，^[6]人们发现硒有拮抗铅毒性的作用:一方面硒是体内抗氧化系统的重要组成成分,能明显改善铅中毒诱发的脂质过氧化反应,减轻铅的危害;另一方面硒与金属有很强的亲和力,可在体内与铅结合形成金属硒蛋白复合物,从而可降低铅的毒性作用。^[3] 随着工农业的发展，我G土壤环境质量发生了极大变化,土壤污染日益严重,目前我G受镉、砷、铬、铅等重金属污染的耕地面积近2000万hm²,约占总耕地面积的20 %，除耕地污染外,我G的工矿区、城市也存在土壤(或土地)污染问题。因此,结合目前开展的全G**土壤污染普查以及G外**新研究成果,制定有效的土壤环境标准体系,对于预防和治理土壤污染,改善土壤质量尤为重要。
在现行《食用农产品产地环境质量评价标准》中，土壤中的总铅定为≤80mg/kg，土壤中汞定为1.0mg/kg(pH＞7.5).近年来 ,美G、英G、澳大利亚等G在研究铅在土壤中的允许含量时，不采用通常的以食物铅的卫生标准作为依据，而是以铅对儿童的毒害、剂量 ——效应关系及血铅与土铅的关系作为制定土壤环境标准的基础。研究表明 ,当土壤铅含量大于100mg/kg 时 ,儿童血铅含量则大于15μg/100mL,这对儿健康产生了不良的影响，因此我G环境土壤标准中制定的铅临界值远远偏高 ,难以保障儿童的健康发展。重金属通过食物链进入人体。对重金属毒害shou当其冲的是植物。研究表明，适量的硒添加可以缓解重金属对植物的毒害，所以研究硒对铅、汞胁迫下大豆的生长影响是很有必要的。本实验通过测定在硒元素作用下，大豆在重金属铅、汞胁迫下其结瘤率、株高、叶片干重（鲜重）、叶绿素含量、脯氨酸含量、叶片丙二醛含量、光合效率以及过氧化物酶（POD）活性的变化，探究硒元素对铅、汞胁迫下大豆生长的影响。从而探讨重金属与植物的逆境生理关系。
2.材料与方法
2.1实验材料及处理
   本实验采用大豆为研究对象。选取饱满种子消毒，25℃浸种24h催芽2天，移栽于处理过的粗砂培养基内，分为空白组、A组、B组、C组及H组，各组处理见表1
表1 实验各组处理

用Hoagland培养液每2天浇灌一次，每次5mL.每2天滴加重金属铅和汞，各5mL.
2.2营养液及处理液的配制
表2 Hoagland营养液系列成分（1000mL）

	药品	剂量	配制量（mL）	贮存液	用量（mL）
大量元素	KNO3#p#分页标题#e#	0.607g/L	1000	20倍	50
	NH4H2PO4	0.115 g/L	1000	20倍	50
	MgSO4·7H2O	0.493 g/L	1000	20倍	50
	Ca(N03)2·4H2O	0.945 g/L	1000	20倍	50
微量元素	H3BO3	2.86 mg/L	1000	1000倍	1
	MnCl2·4H2O	2.13 mg/L
	ZnSO4·7H2O	0.22 mg/L
	(NH4)6Mo7O24·4H2O	0.02 mg/L
	CuSO4·5H2O	0.08 mg/L
半微量元素	Fe-EDTA	6.51mg/L	500	500倍	1

2.3主要仪器及试剂
2.3.1主要仪器
智能光照培养箱（SPX-GB型，上海跃进医疗器械有限公司）
电子天平（AL204型，梅特勒-托利多仪器有限公司）
分光光度计（722型，上海光谱仪器有限公司）
高速离心机（TGL-20B C型，上海安亭科学仪器厂）
电热恒温水浴锅（DK-S24型，上海森信实验仪器有限公司）
电导率仪（DDS-307A型，上海精密科学仪器有限公司）
智能光照培养箱（SPX-GB型，上海跃进医疗器械有限公司）
电子天平（AL204型，梅特勒-托利多仪器有限公司）
分光光度计（722型，上海光谱仪器有限公司）
高速离心机（TGL-20B C型，上海安亭科学仪器厂）
电热恒温水浴锅（DK-S24型，上海森信实验仪器有限公司）
电导率仪（DDS-307A型，上海精密科学仪器有限公司）
ph计（PHS-3D型，雷磁）
2.3.2主要试剂
30%过氧化氢、80%乙醇、丙酮、茚三酮试剂、人造沸石、石英砂、碳酸钙、冰醋酸、三氯乙酸、标准脯氨酸溶液、硫代巴比妥酸（TBA）溶液（用10%TCA配制0.6%的TBA溶液）。
2.4 实验方法
2.4.1实验植物大豆的植株苗长
 
2.4.2实验植物大豆的根冠比
 
2.4.3实验植物大豆植株叶片丙二醛含量
称取大豆叶1.0g，加入10%TCA2mL和少量石英砂研磨成匀浆后，进一步加入10%TCA8mL于研钵中充分研磨，匀浆液移入5mL的离心管中，一4000r/min离心10min，收集上清液2mL再加入0.6%TBA混匀在试管上加盖置于沸水浴中煮沸15min，迅速冷却离心。以2mL水为空白对照，取上清液测，采用硫代巴比妥酸法测定在450nm、532nm和600nm下的OD值。计算公式如下：
C(μmol/L)=6.45（A₅₃₂-A₆₀₀）-0.56A₄₅₀；
MDA含量(μmol/g)=C×V×10^-3/W.
式中：C——丙二醛的浓度(μmol/L)；V——提取液总体积（mL）；
  W——样品质量（g）
2.4.4实验植物大豆植株叶片脯氨酸（Pro）含量的测定^[7][7]
绘制标准曲线：吸取脯氨酸标准母液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL分别放入7支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水**2.0mL，其脯氨酸含量分别为0，2.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0μg.分别吸取上述标准液2mL，加冰醋酸2mL，茚三酮试剂2mL加入试管中，混匀后加玻璃球赛，在沸水浴中加热15min。用分光光度计于515nm下进行比色测定，以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。
植株样品液的提取：选取植株功能叶片1.0g，用3mL80%乙醇研磨（放少许石英砂）成匀浆。用2mL80%乙醇洗涤研钵，将提取物和洗液**于试管中，加盖于黑暗中温室下提取24h。将提取液在放有活性炭的滤纸上进行过滤，重复过滤一次，记下体积。将滤液置于试管中加其重量1/5的人造沸石强烈震荡5min。将上层液在离心机上以4000r/min离心10min上清液备用。
   样品溶液的测定：取2mL上清液置于试管中，再加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮试剂，加盖密封在沸水浴加热15min。用3mL80%乙醇代替样品液作为对照。在分光光度计上测510nm处各样品的吸光度，从标准曲线上求样品液中脯氨酸含量。
         脯氨酸[μg/g(干或鲜样)]=（C×V_T/A）/W
（注：C---由标准曲线上查得的脯氨酸的质量（μg）；V#p#分页标题#e#_T---提取液总体积；A---测定液体积（mL）；W---样品质量（g）
 
2.4.5实验植物大豆植株叶片叶绿素质量分数的测定^[8]
称取大豆0.5g，加入纯丙酮5mL，再加入少许碳酸钙和石英砂于研钵中研磨成匀浆后加入80%丙酮3mL继续研磨，将研磨液移入10mL离心管中，并用2mL80%丙酮洗涤研钵，后一并导入，以3000r/min离心10min，收集上清液并用80%丙酮定容**20mL。取上清液1mL，加入80%丙酮4mL，以80%丙酮为对照。采用分光光度法, 在波长为645nm、663nm下测定。计算公式如下：
C_a=12.7OD₆₆₃-2.69OD₆₄₅；
C_b=22.9OD₆₄₅-4.68OD₆₆₃；
C_T=C_a+C_b=8.02OD₆₆₃+20.21OD₆₄₅；
叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。
（注：Ca、Cb、 C_T分别表示叶绿素a、叶绿素b、总的叶绿素，单位为mg/L）计算。
 
2.4.6实验植物大豆植株叶片超氧化物歧化酶（POD）的测定^[7]
称取植物材料0.1g，加20mmol/L KH₂PO₄ 0.5mL于研钵中研磨成匀浆后转入1.5mL的离心管中。用0.5mL20mmol/L KH₂PO₄溶液冲洗研钵后也转入上述离心管中。12000r/min离心10min，上清液即为粗酶提取液。
取光径1cm比色杯2只，于一只中加入反应混合液3mL，上述酶20uL（如酶活性过高可适当稀释）混匀后立即开启秒表计时，从**分钟开始于分光光度计470nm波长下读取OD值，每隔1min读数一次，连续读数3分钟。以每分钟OD变化值表示酶活性大小，即以△OD470/min·mg蛋白质（或鲜重g）表示。 
2.4.7实验植物大豆植株叶片相对电导率的测定
称取用蒸馏水洗净叶片污物的大豆两份，每份1.0g,分别放在100mL的编号为A和B的两个烧杯中，各加入50mL的蒸馏水。A杯常温处理，B杯称重后盖上表面皿，煮沸10-15min,冷却后再称重并加蒸馏水**原重量。把两杯在室温下放置24h后，用电导率仪测A杯、B杯两杯的电导率，即用电导率法测定。按下列公式计算：
R（%）=（R₁/R₂）*100
2.4.8实验植物大豆植株光合效率的测定；
用Handy PEA仪器测定
2.4.9实验植物大豆植株结瘤率的测定；
 
2.4.10实验植物大豆植株根系所在沙质培养基pH的测定。
用ph计测定
3 结果与分析
3.1铅对大豆生长的影响
3.1.1铅对大豆植株苗长的影响
3.1.2铅对根冠比的影响
3.1.3 铅对丙二醛（MDA）含量的影响
3.1.4 铅对脯氨酸（Pro）含量的影响
3.1.5 铅对叶绿素含量的影响
3.1.6 铅对过氧化物酶（POD）的影响
3.1.7 铅对电导率的影响
3.1.8 铅对光合效率的影响
3.1.9 铅对结瘤率的影响
通过硒对铅胁迫下的豌豆在种子的萌发、植株的生长、根尖细胞分裂及生理代谢等方面的研究表明,低浓度的硒能缓解一定浓度的铅毒害,增强植物的抗逆境胁迫能力。如当铅浓度 ≤100 mg/ L时,≤1. 0 mg/ L硒可促进铅胁迫下豌豆根尖细胞分裂,使种子加速萌发,加快幼苗生长;加入适宜浓度的硒后,硒通过保护叶绿体ATPase活性,提高叶片的叶绿素含量,增强植物的光合作用,从而起到解毒效应。而解毒效应与维持植物体内酶活性平衡密切相关。在铅浓度≤100 mg/ L时,≤1. 0 mg/ L硒使植物体内使活性氧的清除和生成处于相对的低水平平衡状态,内环境的稳定,确保了各种生理活动的正常进行,从而表现出防护作用。但抗氧化酶的保护作用是有一定限度的,当硒浓度大于5. 0 mg/ L时,硒则与铅共同胁迫,致使代谢出现紊乱,各种生命活动受到严重抑制。所以,农业生产中可用硒做微肥施用,抑制植物吸收铅等重金属,减少它们进入食物链,从而降低铅污染的危害,也可提高植物的含硒量,补充和改善人畜硒营养水平。^[9]
3.2 汞对大豆生长的影响
3.2.1汞对大豆植株苗长的影响
3.2.2汞对根冠比的影响
3.2.3 汞对丙二醛（MDA）含量的影响
3.2.4 汞对脯氨酸（Pro）含量的影响
3.2.5 汞对叶绿素含量的影响
3.2.6 汞对过氧化物酶（POD）的影响
3.2.7 汞对电导率的影响
3.2.8 汞对光合效率的影响
3.2.9 汞对结瘤率的影响
 
3.3 铅和汞对大豆生长的影响
4 讨论
5结论
参考文献
附录：
实验所用主要仪器及相关药品
1.实验植物大豆的植株苗长
仪器：直尺
2.实验植物大豆的根冠比
仪器：剪刀、电子天平
3.实验植物大豆植株叶片丙二醛含量
仪器：722型分光光度计、比色皿、高速离心机、离心管、电子天平、研钵、恒温水浴锅、具刻度试管、剪刀、移液管、移液枪
药品：三氯乙酸（TCA）、石英砂、硫代巴比妥酸（TBA）
4.实验植物大豆植株叶片脯氨酸（Pro）含量的测定
仪器：高速离心机、离心管、电子天平、研钵、恒温水浴锅、具刻度试管、剪刀、移液管、移液枪、722型分光光度计、恒温水浴摇床
药品：冰醋酸、人造沸石、活性炭、磷酸、脯氨酸、无水乙醇、茚三酮
5.实验植物大豆植株叶片叶绿素质量分数的测定
仪器：高速离心机、离心管、电子天平、研钵、恒温水浴锅、具刻度试管、剪刀、移液管、722型分光光度计
药品：丙酮、碳酸钙、石英砂 
6.实验植物大豆植株叶片超氧化物歧化酶（POD）的测定#p#分页标题#e#
仪器：高速离心机、离心管、电子天平、研钵、具刻度试管、移液管、722型分光光度计、秒表