摘要：乳化性质是蛋白质的一项重要功能性质，包括乳化活性和乳化稳定性。本文主要通过对蛋白乳化性质的介绍，综述了其测定方法、不同的处理方式和不同的物化因素对乳化性的影响。
关键词：蛋白质 乳化性 测定方法 影响因素

1 前言

乳化性质（Emulsibility）是蛋白质的一项重要的功能性质，是指油品和水形成乳状液的能力，包括乳化活性（Emulsifying Properties）和乳化稳定性（Emulsifying stability）两个方面。乳化活性是指蛋白质在促进油水混合时，单位质量的蛋白质（g）能够稳定的油水界面的面积（m²）；乳化稳定性是指蛋白质维持油水混合不分离的乳化特性对外界条件的抗应变能力。
    蛋白质乳化性是指蛋白质能使油与水形成稳定的乳化液而起乳化剂的作用^[1]。

2 乳化性质的测定方法

2.1 乳化活性的测定方法

2.1.1 分光光度法

阮诗丰^[2]等人采用722S型分光光度计对大豆分离蛋白乳化活性进行了测定。课题中具体的试验方法如下：用微量取样器取出底部的乳状液50μL，用0.1%(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)溶液稀释到一定倍数后放入比色皿中，以相同的SDS溶液作参比液，立即测定其在500nm处的吸光度A。根据赵G华等^[3]的方法进行简化，乳化活性EA用零时刻的吸光度来表征：
EA=A₀
或用乳化活性指数，即每克蛋白质的乳化面积来表示^[4]：

式中：C：溶液中样品蛋白质浓度；Φ：油相体积分数；N：稀释倍数
用分光光度计法测定多种大豆分离蛋白的乳化活性，每种测定均重复多次，计算结果的标准方差(SD:Standard deviation)和变异系数(CV:coefficient of variation)来反映此测定方法重复性。
邓塔^[5]等人在研究大豆蛋白乳化性质的课题中，以脱脂大豆粉为实验对象，取一定体积质量分数为2.0%的蛋白质溶液，加入同体积的大豆色拉油，以6400r/min的速度高速搅拌2min，之后在0min取样100，以0.1%（w/v）SDS（十二烷基磺酸钠，pH=7.0）稀释50倍，以SDS溶液为空白，测定500nm处的吸光度值，以0min的吸光度值表示乳化性（EA）。

2.1.2 电导法

    称取一定量的大豆分离蛋白，溶解后使蛋白质溶液浓度在0.3 %~0.5%( w/v)，10000 r/min 高速搅拌，同时用蠕动泵以4.0 mL/min的速度匀速向其中滴加大豆色拉油，用雷磁数据采集软件采集电导值数据，当电导值发生突变时，停止加油，记录耗油量 V_k。测定不同质量的蛋白质乳化油脂的量，通过多组数据进行回归分析，计算出蛋白质的乳化能力 EC^[6]：
Y=aX+b
    其中
        Y：总耗油量Vk(mL)
        X：蛋白质量M(g)
        A：该种蛋白质的EC(mL/g)

2.2 乳化稳定性的测定方法

2.2.1 分光光度法

    分光光度法测蛋白乳化稳定性的原理是乳化性越好，颗粒越小，吸光度越小；乳化稳定性越好，吸光度随时间的变化越小，也即是粒径变化不大。
    高丽^[7]等人对大豆蛋白乳化稳定性进行了研究，课题中以优质大豆为研究对象，采用分光光度法测定的大豆蛋白的乳化稳定性。具体方法如下：将豆乳用蒸馏水稀释28倍，用离心机以4000r/min离心5min，于785nm波长下测定离心前后的吸光度A。用下式计算豆奶的稳定性
R＝A₂/A₁
式中，R为稳定性系数；A₂为离心后的吸光度；A₁为离心前的吸光度。R≤1，R值越大，说明豆乳的稳定性越好。
    管军军^[8]等人采用分光光度法对大豆分离蛋白的乳化稳定性进行了测定，结果表明，用吸光值比K可较好地表示乳化稳定性。取9 mL0.1%(W/V)待测样品蛋白液（样品蛋白溶于0.2 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液中），加入3 mL大豆色拉
油，在10 000 r/min，25℃下搅拌1 min，分别在搅拌后0 min、5 min取样。以0.1%(W/V)SDS(pH7.0)稀释50倍，测定在500 nm处的吸光值，以SDS溶液为空白，以0时刻的吸光值表示乳化性(EA)。乳化稳定性(ES)用乳化稳定指数(ESI)表示：

式中：A₀———0时刻的吸光值；
      ΔT———时间差，min；
      ΔA———ΔT内的吸光值差
上式可写成：

式中：At———t时刻的吸光值。
    令K=A_t/A₀，则当ΔT一定时，K与ESI成正比关系。为了避免计算时出现ΔA为0及负值，我们引进吸光值比K来描述乳化稳定性，这里K=A₅/A₀(A₅为t=5 min时的吸光值)。
顾楠^[9]等人在研究不同处理方式对鹰嘴豆分离蛋白乳化性质的影响实验课题中，采用分光光度法测定乳化稳定和乳化活性。具体方法如下：取一定量的鹰嘴豆分离蛋白溶于100mL的蒸馏水( 或一定离子强度的盐溶液) 中，调节所需的pH，量取一定体积的大豆色拉油于蛋白溶液，以10000r/min的速度高速搅拌 2min，制成白色乳状液。分别在0min和15min时取0.5ml乳状液置于50mL的容量瓶中，加入0.1%(w/v)SDS(pH7.0)溶液定容并摇匀，以0.1%SDS溶液作空白，在500nm处测定其吸光度A，其中0min时吸光度A#p#分页标题#e#₀表示为乳化活性EA，乳化稳定性用ES表示：

式中：A₀：乳化液在0min时的吸光值;；A₁₅：乳化液在静置15min后的吸光值。
    分光光度法测定蛋白质的EA（乳化活性）和ESI（乳化稳定性）时，要选择合适的吸光度测定值范围，一般应在0.200~0.800之间。

2.2.2 离心法

     配制 1 %(w/v) 的蛋白质溶液，用 0.1 mol/L 的氢氧化钠调** pH7.0，取一定体积的蛋白质溶液和同体积的大豆色拉油混合，以 10000 r/min 的速度高速搅拌1 min，所得乳状液移3支10 mL 的离心管中，在70 ℃的水浴中恒温25 min，用自来水冷却**室温，然后在2000 r/min的速度下离心10 min，根据乳化层体积计算乳化稳定性^[6]。

2.2.3 混浊度法

     张根生^[10]等人在大豆分离蛋白乳化性的研究中采用混浊度法对蛋白乳化性进行测定。在0.2mol/L、pH7.0磷酸钠缓冲液中配制 1%大豆分离蛋白溶液(W/V)，加入大豆色拉油 0.025L/L，均质后形成均匀的乳化液。分别在0min 和10min 取1ml 新制备的乳化液，加99ml 蒸馏水稀释100 倍，然后取1ml 被稀释的乳化液加入到39ml的十二烷基磺酸钠(SDS 1g/kg)稀释40倍，**终稀释度为4000倍。将**后溶液在500nm下测定吸光值(测定9次取平均值)。EAI和ESI采用如下公式进行计算：

式中，ESI —乳化稳定性(min）：
      A₀—均质后迅速被稀释的乳化液的吸光值；
      A₁₀—乳化液在静止10min 后的吸光值；
      t—时间(本实验是10min)

式中，EAI —乳化活性(ml/g)；
      T=2.303；
      C—乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白浓度(g/ml)；
      Φ—乳化液中油的体积分数(本实验是0.025)；
稀释倍数是 4000

3 不同物化因素对乳化性质的影响

3.1 pH值

   顾楠^[9]等人研究鹰嘴豆分离蛋白乳化性时，采用不同pH值梯度对其进行测定。pH值范围选定为3、5、7、9、11，分别测量在不同pH处理过后的蛋白的乳化活性和乳化稳定性。结果如下：

图1 pH对鹰嘴豆分离蛋白乳化活性及乳化稳定性的影响
在图中很明显的看出pH为5时，蛋白溶解度**小，即鹰嘴豆分离蛋白的等电点，此时蛋白溶解度**差，表面电荷为零，亲水能力下降，吸附在油-水界面上的蛋白含量减少，故乳化活性降低；在静置的过程中，由于不存在静电排斥作用，蛋白质进一步在油-水界面重排乳化，同时在油-水界面堆积促进了高弹性膜的形成，阻止油滴聚集上浮从而提高了乳状液的稳定性。pH从等电点向两侧变化，蛋白质的溶解度增大，蛋白质向油-水界面扩张能力增强，界面面积增大，乳化活力又开始增强，乳化稳定性又逐渐下降。
邓塔^[5]等人在研究大豆乳化性质的课题中，采用不同梯度的pH值对大豆蛋白粉进行处理，加热温度为60℃下，采用1mol/L的盐酸调节大豆蛋白溶液的pH，范围为2.0-6.0，处理30min，测定其乳化性。结果如图：
在此反应温度下，随着酸处理pH降低，大豆蛋白的溶解性降低，经酸处理时11S和7S发生变性，其中11S基本是全部变性，而7S是部分变性。变性蛋白在高温下运动加剧而发生聚集，使蛋白质分子疏水性/亲水性比值降低，减少油表面结合，影响蛋白质乳化性。同时蛋白质分子柔韧性降低，在界面不能迅速展开，影响大豆蛋白的乳化性。另一方面可能是在一定浓度下的大豆蛋白溶液随pH升高，发生羧基去质子化，电荷排布改变，有利于乳化性的提高。
图1 pH值对乳化性的影响

3.2 含油量

顾楠^[9]等人在研究鹰嘴豆分离蛋白的乳化性时，设置不同梯度的含油量，分别为10、15、20、25、30mL，测定其乳化活性和乳化稳定性，结果如下：
 
图2 加油量对鹰嘴豆分离蛋白乳化活性及乳化稳定性的影响
    因为蛋白质是油和水的两亲物质，可自发地迁移**油-水界面，降低表面张力，形成稳定的乳状液，随着加油量的增加，所形成的界面面积增大，因而乳化活力增大；而且随着加油量的增加，乳化稳定性呈现减小的趋势，因为当油含量增高时，乳状液油滴形成的保护膜较薄，导致蛋白质相互聚集下沉或油滴相互聚集上浮，从而使乳状液失去稳定性，故乳状液的稳定性随油量的增加而降低。#p#分页标题#e#

3.3 离子浓度

   顾楠^[9]等人在研究鹰嘴豆分离蛋白乳化性质时，选用不同梯度的离子浓度，分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mol/L的NaCl溶液，测定乳化活性和乳化稳定性。结果如下：
    盐浓度可以对蛋白表面疏水性和结构产生影响。在低盐浓度时，溶液中的Na⁺通过离子键吸附在蛋白质表面，中和蛋白质表面的负电荷，使蛋白质的亲水性降低，疏水性增强，造成蛋白质构象发生变化，形成更加刚性的结构，使蛋白质的溶解性降低，从而使扩散到油-水体系中的蛋白质减少，界面面积减少，乳化活力下降。随着NaCl浓度的升高，更多的Na⁺吸附**蛋白质表面，使蛋白质的亲水性增加，蛋白质分子溶剂化，使蛋白质的溶解性增大，从而使扩散到油-水体系中的蛋白质增多，界面面积增大，乳化活力上升。
 

图3 NaCl浓度对鹰嘴豆分离蛋白乳化活性及乳化稳定性的影响
邓塔^[5]等人采用不同浓度的NaCl处理改性后（加热温度为50℃、pH=6.0、加热时间为60min）的大豆蛋白，分别向5份40mL2.0%的大豆蛋白溶液中添加不同剂量的NaCl，形成0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%系列浓度。不同浓度的Na⁺对改性大豆蛋白乳化性影响见图4：
适当浓度的Na⁺形成水合盐与蛋白质分子上带电基团微结合，提高了蛋白质结合水的能力，促进大豆蛋白溶解度增加和改善分子柔韧性，使其表面活性得到充分展示。
图4 Na⁺对改性蛋白乳化性的影响

4 不同的处理方式对蛋白乳化性质的影响

4.1 微波处理对蛋白质乳化性质的影响

顾楠^[9]等人对鹰嘴豆分离蛋白应用不同处理方式，并研究了这些处理方式对蛋白乳化性质的影响。课题中取100ml浓度为0.5%(w/v)的蛋白质溶液，用 0.5mol/L的NaOH调节pH为7.0，然后置于微波炉中处理，微波炉功率为800w，处理时间分别为0、20、40、6080、100s，处理完后加入20mL大豆色拉油，高速搅拌后根据2.2.1中所述方法测定EA和ES。
测定结果如下图所示：
从图中可以很明确的看出整体趋势呈增加后减少，在微波处理时间为60s时，乳化活性和乳化稳定性都达到**大值。文中分析其原因是，蛋白分子在微波场的诱导下产生极化现象，使维持蛋白空间结构的非共价键（疏水相互作用、二硫键、静电相互作用）被破坏，蛋白分子部分展开，分子的柔性提高，更多的蛋白分子结合到油-水界面，同时，蛋白分子内部的疏水残基暴露在蛋白表面，蛋白表面的疏水性增强，故蛋白的乳化活性和乳化稳定性增强。但是，当微波处理的时间进一步延长时，蛋白分子进一步展开，极化的蛋白分子之间相互吸引，通过疏水相互作用、二硫键、静电相互作用及氢键等重新形成分子聚集体，分子的柔性降低，表面疏水性减弱，蛋白表面积缩小，故乳化性及乳化稳定性呈下降趋势。

图1 微波处理对鹰嘴豆分离蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响

4.2 超声波处理对蛋白乳化性质的影响

顾楠^[9]等人的研究中采用超声波对鹰嘴豆分离蛋白进行处理，观察超声波不同的处理时间对其乳化活性及乳化稳定性质的影响。试验方法类同微波处理，所选用的超声波功率密度为0.3W/cm²，处理时间分别为0、1、2、3、4、5min，结果如下：
从图中明确看出，处理时间为4min时，乳化活性和乳化稳定性达到**大值。这是因为在超声波作用下，蛋白质分子的结构变得疏松，使疏水性多肽部分展开朝向脂质，极性部分朝向水相，故乳化活力增加。但继续延长超声波处理时间，蛋白质变性程度增大，不溶性蛋白质含量增多，乳化活力及乳化稳定性随之又降低。
 

图2 超声波处理对鹰嘴豆分离蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响

4.3 超高压处理对蛋白乳化性质的影响

顾楠^[9]等人在研究鹰嘴豆分离蛋白的课题中，采用不同梯度的超高压进行处理，压力梯度为100、200、300、400、500MPa，处理时间均为15min。测定结果如下：

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图3 超高压处理对鹰嘴豆分离蛋白乳化活性和乳化稳定性的影响
    在压力为400MPa时，其乳化活力和乳化稳定性达到**大值，这是由于超高压使蛋白质结构发生了变化，蛋白质分子内部疏水相互作用逐渐受到破坏，更多的疏水性区域暴露，增加了蛋白的表面疏水性，疏水基团的暴露使蛋白质更易于吸附**油-水界面上并展开，从而提高了乳化性。随着压力的进一步增加，蛋白发生进一步聚集使得溶解性下降，导致吸附到油-水界面上的蛋白浓度下降，所以乳化性和乳化稳定性又出现下降。

4.4 加热时间对蛋白乳化性质的影响

    邓塔^[5]等人采用不同梯度的加热时间对大豆蛋白进行处理，在60℃，pH=5的条件下，处理10~60min大豆蛋白溶液，测定其乳化性。结果如图：

图2 加热时间对乳化性的影响
适当热处理初始阶段蛋白质受热而发生部分变性，多肽链展开增加了分子柔顺性，有利于蛋白质分子在界面快速展开，乳化性得到显著提高。随时间的延长，变性的蛋白质减少，其乳化性增加变缓。