1前言
1.1研究目的和意义
高血压是一种常见的心脑血管疾病，会引起心血管、大脑、肾脏的病变
[1]。降压肽是一种ACE抑制剂，通常用于高血压患者的治疗
[2]。目前，对高血压患者的治疗通常使用化学合成的药物，然而，这些合成药物有一些副作用,包括咳嗽和皮疹
[3]。食源性降压肽来源于天然植物，无副作用，易被人体吸收
[4]。不同的植物来源，降压功效作用也是不同的。
核桃 (核桃) 蛋白质的具有广阔应用前景的新产品和强化身体的好来源
[5]。核桃粕是核桃经过提取油后的副产物，含有29.65%蛋白质，提油后的核桃粕多数被用作饲料，资源造成了一定的浪费，酶解核桃粕蛋白制备降压肽可以促进核桃粕的深加工，实现资源的综合利用。本文采用两种不同的蛋白酶共同作用水解蛋白，采用双酶复合水解可以增加蛋白酶的特异性催化位点
[6]，可以提高可溶性蛋白含量及功能性多肽的产量和转化率
[7]，并且增大了蛋白的水解度，也一定程度上增大了蛋白原料对肽的转化率，进而可以改善蛋白质水解液中功能性多肽的特性。本实验将两种蛋白酶分两步进行酶解，全面研究双酶分步酶解工艺制备核桃粕降压活性肽的工艺及参数，然后用响应面法对其工艺进行优化。
1.2降压肽的研究进展
日本是对食源性降血压肽研究**多的G家，且已经有此类降血压肽的商品上市，以其天然无毒的特性受到了广大消费者的信赖，而我G在此项的研究才刚刚起步
[8]，目前临床上的高血压的药物治疗尽管有效可是也存在弊端，如降压过度、泌尿系统发生病变、持续性咳嗽、味觉失真和血管神经性水肿等，而通过蛋白酶的水解获得的具有降血压活性的多肽不仅可以对高血压患者起到降血压的作用，对身体体质没什么影响，适合患者长期服用。随着G民生活水平的提高，人们的自我保健意识和安全意识也在逐渐加强，这种降血压肽会逐渐被人们接受，成为预防，缓解和治疗高血压的一个有效手段。
2 材料与方法
2.1 材料和设备
核桃粕，康福寿核桃油加工有限公司；2709碱性蛋白酶(Alcalase)购于北京博奥拓达科技有限公司；风味蛋白酶购于sigma公司；FAPGG，呋喃丙烯酰三肽，购于sigma公司；ACE，血管紧张素转换酶，购于sigma公司；正己烷、盐酸、浓硫酸、氢氧化钠等均为分析纯。试验用水均为去离子水。
快速恒温数显水浴锅 金坛市医疗仪器厂；PHS-3 C雷磁
ph计 上海精科；BS 2000 S电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司；FDU-1200冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；ELx 808酶标仪 Thermo公司；SH 21-1磁力搅拌器 上海梅颖浦仪表制造有限公司；DNP-9272电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司。
2.2 工艺流程
低温脱脂核桃粕→过60目筛→脱脂→提取核桃蛋白→碱性蛋白酶和风味蛋白酶联合酶解条件的优化→核桃ACE抑制肽
2.3 核桃脱脂粉的制备
核桃粕经粉碎后过60目筛，用正己烷以1:5(w/v)的料液比在磁力搅拌器上提取1h后进行抽滤，取滤渣重复用正己烷提取**滤液无色透明时收集滤渣，然后用恒温干燥箱烘干溶剂，置于冰箱4℃冷藏备用。
2.4 核桃蛋白的提取
采用碱溶酸沉法提取核桃蛋白。参照毛晓英
[9]的方法，略改。以购买的核桃脱脂粕为原料，将其烘干后粉碎，然后通过95%醇洗(1:10,(w/v))，过滤，把滤饼置恒温干燥箱烘干溶剂。然后用去离子水配制蛋白质溶液(1:26,(w/v))，调节蛋白液的pH值到11.0，置磁力搅拌器上53℃搅拌1.5h后7000r/min 25℃离心15min，取上清液，调节pH**4.5，搅拌1h，7000r/min 25℃离心15min，水洗沉淀，调节pH**中性后冻干，置于冰箱4℃冷藏备用。
2.5 水解蛋白酶的筛选
表1 四种商业酶**适作用条件和酶活力
Table 1 The optimum hydrolysis conditions and the enzymatic activity of four commercial enzymes
|
酶种类 |
**适pH |
**适温度(℃) |
酶活力(U/g) |
|
碱性蛋白酶 |
8.5 |
55 |
7.1×104 |
|
中性蛋白酶 |
7.0 |
40 |
6.3×105 |
|
风味蛋白酶 |
6.5 |
50 |
2.0×104#p#分页标题#e# |
|
木瓜蛋白酶 |
6.8 |
55 |
8.2×105 |
将上述的四种蛋白酶在各自的**适酶解条件下对核桃蛋白进行酶解，以ACE抑制率和水解度为指标，选出制备核桃降压肽的**适用酶，结果见图2：
图1 四种酶解液的ACE抑制率及其水解度的比较
Fig.1 Comparison the four kind of enzyme solution on ACE inhibition rate and Hydrolysis degree
由图1可以得到，不同蛋白酶对核桃粕蛋白的水解能力存在明显差异，其中水解液的ACE抑制率和水解度相对较高的是碱性蛋白酶和风味蛋白酶。ACE抑制肽构效关系研究表明，强ACE抑制活性肽的C-端氨基酸倾向于疏水性氨基酸。研究报道表明，核桃脱脂粉和核桃蛋白分离组分的氨基酸组成中，以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量较高，且主要以酸性氨基酸和疏水性氨基酸为主
[9]。研究结果表明，对核桃蛋白的水解能力碱性蛋白酶明显高于风味蛋白酶、风味蛋白酶高于中性蛋白酶和木瓜白酶，说明核桃蛋白的结构中存在较多的碱性蛋白酶和风味蛋白酶的作用位点，从而更有利于ACE抑制肽的释放。这与杨越
[10]以葵花籽为原料酶法制备ACE抑制肽报道的结果比较相似。综合考虑选择碱性蛋白酶和风味蛋白酶为**适酶。
2.6 实验方法
表2.碱性蛋白酶和风味蛋白酶的**佳酶解工艺参数比较
Table2.The optimum technology of Alcalase and Flavourzyme
|
|
碱性蛋白酶 |
风味蛋白酶 |
|
酶解pH |
8.5 |
6.5 |
|
酶解温度（℃） |
55 |
50 |
|
底物浓度（g/mL） |
30 |
15 |
|
酶解时间（h） |
2 |
3 |
|
酶添加量（U/g） |
7000 |
6000 |
分别将碱性蛋白酶和风味蛋白酶在各自**佳工艺条件下进行酶解核桃蛋白，同时进行碱性蛋白酶和风味蛋白酶的分步酶解试验，具体操作如下：
称取一定量的核桃蛋白，加去离子水配制成一定浓度的水解底物于水浴锅中90℃ 10min处理后，在碱性蛋白酶的**佳反应条件下（即温度为55℃，pH8.5）加入碱性蛋白酶，随着反应的进行，酶解液的pH逐渐下降，滴加0.1mol/L的NaOH溶液以维持pH不变，分别间隔一定时间记录消耗的NaOH量，碱性蛋白酶酶解结束后无需灭酶
[11]。将水解温度和pH调节**风味蛋白酶的**佳条件（即温度为50℃，pH6.5），用同样的方法保持系统的pH不变，同时间隔一定时间记录消耗的NaOH量。酶解结束后酶解液立即于90℃沸水中灭酶10min，8000r/min离心15min取上清液进行水解度和ACE抑制率测定。
2.7 核桃降压肽制备的单因素研究
以核桃降压肽的ACE抑制率和水解度为指标分别考察双酶复配配比、底物质量浓度(g/L)、酶添加量(U/g)、三个因素对核桃降压肽制备的影响，进行单因素实验。
2.7.1
底物浓度对酶解液ACE抑制率和水解度影响
2.8 核桃降压肽制备的响应面实验设计
在单因素研究的基础上，以双酶复配配比、底物质量浓度(g/L)和酶添加量(U/g)三个因素为自变量，以ACE抑制率为响应值，设计响应面分析实验。因素水平及编码表见表3。
表3因素水平及编码表
Table1.The table of factors and level
|
编码水平 |
A底物浓度 |
B双酶复配配比 |
C加酶量 |
|
|
g/L |
U/U |
U/g |
|
-1 |
20 |
2:1 |
5000 |
|
0 |
30 |
1:1 |
6000 |
|
1 |
40 |
1:2 |
7000 |
2.9 检测指标
2.9.1 水解度的测定
采用 pH-Stat法
[12#p#分页标题#e#]。
2.9.2 ACE抑制率的测定
在96孔酶标板上按表3设计添加反应物开始反应，在340nm波长条件下，用酶标仪测吸光值
A1。使其在37℃的恒温培养条件下反应30min，测量吸光度A
2，作3组平行试验
[13]。
ACE抑制率的计算公式如下：
式中：Δ
Ab为加入缓冲基质时吸光度在 30min内的变化；Δ
Aa为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。
表4 ACE抑制活性的测定
Table 4 The determination of ACE inhibition activity
|
添加物 |
样品孔/uL |
空白孔/uL |
|
ACE(0.1U/mL) |
10 |
10 |
|
FAPGG(1mmol/L) |
50 |
50 |
|
ACE抑制剂 |
40 |
0 |
|
超纯水 |
0 |
40 |
注：1.FAPGG(1.0 mmol/L)：取3. 994 mg FAPGG加基质缓冲液2，定容**10 mL，溶解混合，置4℃避光放置；2.基质缓冲液1： pH8.3、100mmol/L的硼酸缓冲液；3.基质缓冲液2：pH8.3、100mmol/L的硼酸缓冲液(含300mmol/L NaCl)。
3 碱性蛋白酶-风味蛋白酶分步酶解
3.1 单因素试验
3.1.1底物浓度对酶解液ACE抑制率和水解度影响
图3-1.底物浓度对酶解液ACE抑制率和水解度影响
Fig3-1.The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by substrate concentration
由图3-1可知，随着底物质量浓度的增大ACE抑制率和水解度先增大后减小，由于酶解初期随着底物质量浓度增大多肽含量增加，故ACE抑制率和水解度增大，在底物质量浓度为30g/L时达到**大值，继续增大底物质量浓度，ACE抑制率和水解度都相对有所减小，原因可能是随着底物质量浓度的增大，酶解液的有效水分含量过低，减少了在反应过程中底物和蛋白酶间碰撞的机会，对水解产生抑制的作用
[14]。选择**适底物质量浓度为30g/L。
3.1.2
双酶复配配比对酶解液ACE抑制率和水解度影响
图3-2.双酶复配配比对酶解液ACE抑制率和水解度影响
Fig3-2. The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by the double enzyme distribution ratio
试验结果如图3-2所示，酶添加总量保持不变，碱性蛋白酶和风味蛋白酶按一定的比例添加，由试验结果图看出，随着碱性蛋白酶与风味蛋白酶复配比例的减小，水解度呈先快速增大后缓慢减小的趋势，从复配比例3:1到2:1的过程中增幅较大，双酶复配配比为2:1时水解效果明显强于3:1；二者添加量比例继续减小，风味蛋白酶的相对添加量不断增大，水解度和ACE抑制率呈现下降趋势。因为水解度尽可能大的情况下，酶解液中的肽含量增加，降压活性肽含量也相应增加，故ACE抑制率增大，反之亦然。选择**适宜的碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加量比例为2:1。
3.1.3 加酶量对酶解液ACE抑制率和水解度影响
图3-3 加酶量对酶解液ACE抑制率和水解度影响
Fig.3-3 The influence of enzyme solution ACE inhibition rate and Hydrolysis degree by enzyme dosage
由图3-3可知，随着加酶量的增大，酶解液的ACE抑制率和水解度增大，在加酶量为7000U/g时ACE抑制率达到**大值，原因可能是随着酶浓度的增加，有利于酶与底物的结合，对酶解有促进的作用。随着加酶量的继续增大，酶解液的ACE抑制率和水解度略有降低，原因可能是一部分具有ACE抑制活性的多肽被进一步水解成不具有降压活性的小肽。故选择7000U/g为**适加酶量。
3.2 Box-Benhnken优化试验
3.2.1 响应面分析因素与水平的选取
依据单因素分析结果选定底物浓度(g/L)、双酶复配配比、加酶量(U/g)三因素，分别选取3个水平，以酶解上清液的ACE抑制率为测定指标，设计响应面试验并进行操作，因素水平表及编码如表所示。
表3-1.因素水平及编码表
Table3-1.The table of factors and level
|
编码水平 |
A底物浓度 |
B双酶复配配比 |
C加酶量 |
|
|
g/L |
U/U |
U/g |
|
-1 |
20 |
2:1 |
5000 |
|
0 |
30 |
1:1 |
6000 |
|
1 |
40 |
1:2 |
7000 |
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3.2.2 响应面试验设计及结果
由Design-Expert 8.0统计分析软件的试验设计功能可知，三因素三水平的中心组合设计包括17个试验方案，具体的试验方案及试验结果如表3-2所示。
表3-2.响应面试验设计及结果
Table3-2.The design and results of the response surface experimental
|
试验号 |
A底物质量浓度 |
B双酶复配配比 |
C加酶量 |
Y ACE抑制率% |
|
1 |
-1 |
0 |
1 |
66.73 |
|
2 |
0 |
-1 |
1 |
62.73 |
|
3 |
0 |
1 |
1 |
65.51 |
|
4 |
1 |
0 |
1 |
65.71 |
|
5 |
1 |
1 |
0 |
62.91 |
|
6 |
0 |
0 |
0 |
67.03 |
|
7 |
1 |
0 |
-1 |
66.12 |
|
8 |
-1 |
-1 |
0 |
62.89 |
|
9 |
0 |
0 |
0 |
67.85 |
|
10 |
1 |
-1 |
0 |
63.22 |
|
11 |
-1 |
0 |
-1 |
66.71 |
|
12 |
0 |
-1 |
-1 |
65.41 |
|
13 |
0 |
0 |
0 |
67.43 |
|
14 |
0 |
0 |
0 |
67.72 |
|
15 |
-1 |
1 |
0 |
64.91 |
|
16 |
0 |
1 |
-1 |
64.59 |
|
17 |
0 |
0 |
0 |
67.2 |
利用Design-Expert 8.0统计软件，通过回归分析对表3试验数据进行回归拟合，得到底物浓度（A）、双酶复配配比（B）、加酶量（U）三个因素对ACE抑制率（Y）的二次回归方程为：
Y=43.66000+0.87080A+26.13850B-7.197915-003C-0.11650AB-3.380041-00**C+5.659603-003BC-0.011030 A
2-11.44200 B
2 -8.017771-008 C
2
对回归方程进行方差分析，结果见表3-3
表3-3 回归模型及方差分析结果
Table 3-3 Decolorization regression model and analysis of variance
|
方差来源 |
平方和 |
自由度 |
均方 |
F值 |
Pr>F |
显著性 |
|
模型 |
49.95 |
9 |
5.51 |
53.95 |
＜0.0001 |
** |
|
A |
1.34 |
1 |
1.34 |
13.17 |
0.0084 |
** |
|
B |
1.68 |
1 |
1.68 |
16.48 |
0.0048 |
** |
|
C |
0.58 |
1 |
0.58 |
5.66 |
0.049 |
* |
|
AB |
1.36 |
1 |
1.36 |
13.29 |
0.0082 |
** |
|
AC |
0.046 |
1 |
0.046 |
0.45 |
0.5227 |
|
|
BC |
3.24 |
1 |
3.24 |
31.72 |
0.0008 |
** |
|
A2#p#分页标题#e# |
5.12 |
1 |
5.12 |
50.15 |
0.0002 |
** |
|
B2 |
34.45 |
1 |
34.45 |
337.3 |
<0.0001 |
** |
|
C2 |
2.74E-03 |
1 |
2.74E-03 |
0.027 |
0.8746 |
|
|
残差 |
0.71 |
7 |
0.1 |
|
|
失拟误差 |
0.24 |
3 |
0.081 |
0.69 |
0.5986 |
不显著 |
|
纯误差 |
0.47 |
4 |
0.12 |
|
注：** P＜0. 01，差异极显著；*P＜0. 05，差异显著。
由表3-3的方差分析可知，模型的F值为53.95，P<0.0001，说明该模型是极显著的，一次项A，B，C均影响极显著，说明双酶复配配比、底物质量浓度和加酶量对ACE抑制率和水解度具有显著性影响，交互项AD，BD，CD的偏回归系数达到极显著水平。失拟项在0.05水平上不显著(P=0.6059)，说明残差均由随机误差引起。响应面曲线越陡则影响越显著，从下图可以看出碱性蛋白酶与风味蛋白酶添加量比例与底物浓度交互作用曲线相对较陡，说明二者交互作用相对明显，对水解效果的影响相对较强，酶解温度曲线变化则比较平缓，对水解效果影响相对较弱。
3.2.3 **佳条件的响应面优化
图3-4双酶复配配比底物浓度交互作用响应曲面
Fig3-4.The response surface of the influence of ACE inhibition rate by the interation of substrate concentration and the adding quantity proportion
图3-5. 双酶复配配比和加酶量交互作用响应曲面
Fig.3-5 The response surface of the influence of ACE inhibition rate by the adding quantity proportion and enzyme dosage
利用Design-Expert 8.0软件进行工艺参数的优化组合，得到碱性蛋白酶-风味蛋白酶分步酶解核桃蛋白制备ACE抑制肽的**佳工艺为：底物质量浓度28.80g/L、加酶量6000U/g、双酶复配配比3:2，ACE抑制率可达到67.7217%。根据实验室条件调整酶解工艺为底物质量浓度29g/L、加酶量6000U/g、双酶复配配比3:2，得到的实际抑制率67.05%。
3 结论
本研究分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶酶解核桃蛋白制备核桃降压肽，以ACE抑制率和水解度为指标，对比结果筛选碱性蛋白酶和风味蛋白酶为**适酶。
在单因素实验的基础上进行响应面试验，以ACE抑制率为指标，确定了双酶联合水解工艺的**佳参数底物质量浓度28.80g/L、加酶量6000U/g、双酶复配配比3:2，ACE抑制率可达到67.7217%。根据实验室条件调整酶解工艺为底物质量浓度29g/L、加酶量6000U/g、双酶复配配比3:2，得到的实际抑制率67.05%。本研究得到了较高的ACE抑制率结果为核桃粕的深加工提供了一定的指导方向，从而为进一步拓宽核桃产业提供思路和理论指导奠定了基础。
4 展望
虽然在动物实验和临床中对降血压肽的效果进行了大量的研究，然而尚需对生物体内活性形式的识别和降压作用的不同机制进一步研究。新技术的应用，如 DNA 微阵列技术在基因表达方面研究降血压肽的效果，可以为降血压肽的作用方式提供新的见解
[15]。但在任何情况下，支持健康声明的证据必须是基于人类的临床试验。
高血压被称为人类健康的 “无形杀手”它不仅是一个独立的疾病，同时又是心脑血管疾病致病的重要危险因素，导致心、脑、肾、血管、眼底的结构和功能的改变和损害，引起相关疾病的发生
[16,17]。我G人群高血压患病率呈增长态势，每 5个成人中就有1人患高血压病，估计目前全G高血压患者**少2 亿人，每年新发生高血压1000×10
4人
[18]，因此治疗高血压成为医学界面临的一项艰巨任务。化学合成的降压药物可以一定程度的有效降低血压，但同时也会有副作用，从食物中制备提取具有降血压活性的多肽被证实对高血压有降低作用、易于吸收且没有副作用，所以以核桃粕为原料制备具有降血压活性的多肽具有很广阔的前景和重大意义。#p#分页标题#e#
